肌营养不良症

强直性肌营养不良病人的三核苷酸数目的检测

更新时间:2011-10-21 12:33:36 | fx_8c447f7a

强直性肌营养不良病人的三核苷酸数目的检测

中风与神经疾病杂志 1999年第4期第16卷 论著与经验总结

作者:王晔 郑惠民 谢惠君 崔毅

单位:200433 上海 第二军医大学长海医院神经内科

关键词:强直性营养不良;三核苷酸;重复数目

  摘 要 目的 检测强直性肌营养不良(dm)病人的三核苷酸重复数目。方法 采用32p标记的pcr和聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对3例dm病人的外周血和肌活检组织的ctg重复数目进行了分析。结果 3例dm病人ctg重复扩增片段分别为146bp、149bp和149bp,相应的ctg重复数为11、12、12,其基因型为11/11、12/12、12/12。结论 dm病人的ctg重复数目大多在50~4000不等,但是少数病人的ctg重复数目可在正常范围,一般认为是遗传异质性或基因突变所致。ctg重复数目正常的病人并不能排除dm的诊断。

  强直性肌营养不良(myotonic dystrophy,dm)是常染色体显性遗传病,可累及多系统如骨骼肌、晶状体、心肺、胃肠道、中枢和周围神经、骨、皮肤和性腺,临床表现各异。任何年龄均可发病,临床上可见早发现象(anticipation)和不同的外显率(penetrance)。根据国外文献,多数dm病人ctg重复次数在50~2000不等,最高可达8000,而一般正常人的ctg重复次数在5~40之间。ctg的重复次数有种族特殊性和高度多态性[1~4]。我们采用32p标记的pcr、聚丙烯酰胺凝胶电泳对3例dm病人外周血和肌活检标本的ctg重复序列进行了检测。

  1 资料和方法

  临床资料 3例dm病人经我院临床诊断,符合《实用神经病学》标准[5]。例1,女性,29岁。自17岁起出现右上肢无力,以后出现左上肢无力、双下肢无力。23岁双手握拳后不能立即松开,上楼困难,眼睛、口唇不能闭紧。25岁结婚生一子,现已18个月。体检:面肌轻度萎缩,双眼及口唇闭合不全。四肢近端肌力3级,远端肌力5级,肌张力正常。右手握拳后不能松开。下蹲后不能立即起立。行走呈鸭步,额前秃发,轻度白内障。四肢腱反射迟钝对称。叩击性肌强直(+)。emg示肌源性损害,可见肌强直电位。例2,男性,40岁。16岁时出现双下肢无力,不能做重活,握拳后双手不能立即松开,以后症状逐渐加重,因性功能障碍而离婚。体检:面肌严重萎缩呈斧形脸,鹅颈,四肢肌力、肌张力正常。双手握拳后不能立即松开,双手叩击性肌强直(+),轻度白内障,额前秃发,四肢腱反射正常。emg示肌源性损害,可见肌强直电位。例3,女性,为例2之妹。病情与例2类似,但程度较例2轻。体检:面肌萎缩呈斧形脸,牙齿排列不整齐,额前秃发,轻度白内障,四肢肌力、肌张力正常,双手叩击性肌强直。emg示肌源性损害,可见肌强直电位。

  2 方 法

  2.1 3例dm病人均经肌肉病理证实活检肌肉于-20℃冻存,按文献中常规方法制备外周血和肌活检组织dna[6]

  2.2 pcr反应体系 在pcr循环仪上(美国perkin-elmer9600型),以正链5-cttcccaggcctgcagtttgcccatc-3负链5-gaacggggctcgaagggtcctt-gtagc-3为引物,反应体系10μl[10mmol/l tris-hcl](ph 8.3),1.5 mmol/l mgcl2,0.2mmol/l datp,dttp,dgtp,2μmol/l dctp,0.1μl α-32p-dctp(300mci/mmol),5pmol正链引物,5pmol负链引物,50ngdna和1单位long-expand taq酶。每一标本均先将反应体系于95℃变性2min,最终72℃延伸7min。循环条件为94℃30s,62℃30s,70℃3min,共35循环。

  2.3 电泳和放射自显影 配制7mmol/l尿素的6%变性聚丙烯酰胺胶。将10μl pcr产物与20μl上样液(95%甲酰胺,0.025%二甲苯青,0.025%溴酚蓝和10mmol/l edta)混合,于80℃5min后取3μl上样,在42cm×33cm×0.4cm的96孔点样胶上作垂直电泳,恒压180v,电泳3h,并以m13mp 18的dna序列ladder为dna分子大小的标准。电泳结束后揭胶,烤干,暗室内压片,显影,读片并判断结果。

  3 结 果

  3例dm病人的外周血和肌肉组织dna的ctg重复数目相等,其扩增的分子量片段分别为146bp、149bp、149bp,相应的ctg拷贝数为11、12、12。3例病人的基因型分别为11/11、12/12和12/12(见表1)。

表1 病人不同组织dna的ctg重复数目

病例 ctg重复数目 扩增片段 基因型
外周血 肌肉
1

  2

  3

11

  12

  12

11

  12

  12

146bp

  149bp

  149bp

11/11

  12/12

  12/12

  4 讨 论

  dm是由dmpk基因3,非翻译区ctg三核苷酸重复序列的异常扩增所致。ctg重复序列具有高度多态性和种族特殊性[1~4,7~14]文献报告正常人ctg重复数在5~40之间,多数dm病人ctg重复数目50~4,000不等,最高可达8,000[11]。但亦有少数dm病人ctg重复数目在正常范围的报告[7,8]

  dm是常染色体显性遗传疾病,多系统受累,可见肌肉萎缩,合并不同程度的肌强直、额前秃发、糖尿病、心肺异常、白内障、性功能障碍、特殊面容、智能障碍、睡眠过多、骨骼异常、大脑变性、周围神经受损等。多数作者报告欧美人发病率为1/18,000,davis等报告日本人发病率为1/18,000,ashizawa等报告东南亚人发病率较日本人低,非洲人发病罕见,仅dada于1973年报告了一个尼日利亚家系,国内尚无准确的发病率统计资料[1~4]。我们的病人经临床和病理证实,符合dm诊断,分子生物学检测ctg结果在正常范围。ctg重复扩增在不同组织中表达不同。jasen等报告ctg重复扩增在骨骼肌、心肌、平滑肌中表达明显,而在脑组织和内分泌组织中表达水平低[12]。daumerie等报告1例dm病人ctg重复数目在甲状腺中为外周血淋巴细胞中的7倍[13]。lavedan等检测了9种不同组织中的ctg重复数目,发现最小的扩增见于肝脏,最大的扩增见于肾脏[14]。但我们对3例dm病人的外周血和肌活检组织的ctg检测未能发现上述变化。发生上述改变的原因未明。wong等认为ctg重复扩增是动态突变,可随年龄的增长和疾病的逐渐加重而逐渐扩大[10]。临床上可见某些病人症状迁移数年而无加重。另外,thornton等[7]和reardon等[8]认为,ctg重复扩增在正常范围,说明dm有时可在无ctg重复扩增情况下发生,反映了dm基因位点的异质性。类似的情况可见于cgg重复扩增所致的脆性x综合征和不同基因突变所致的charcot-marie-tooth综合征。因此,虽然多数dm病人ctg重复扩增大于正常,但是有时ctg重复数目正常情况下,并不能排除dm的诊断。对上述3例dm的随访将有助于了解ctg的变化。

  参考文献

  1 zerylnick c,torroni a,sherman sl,et al.normal variation at the myotonic dystrophy locus in global human populations.am j hum genet,1995,56:123.

  2 pizzuti a,friedman dl,caskey ct.the myotonic dystrophy gene.arch neurol,1993,50:1173.

  3 caskey ct,pizzuti a,fu yh,et al.triplet repeat mutations in human disease.science,1992,256:784.

  4 mahadevan m,tsifidis c,sabourin l,et al.myotonic dystrophy mutation:a unstable ctg repeat in the 3,untranslated region of the gene.science,1992,255:1253.

  5 吕传真.强直性肌营养不良.实用神经病学,第2版,上海科技出版社,1994,896~897.

  6 姜 泊,张亚历,周殿元.分子生物学常用实验方法.北京:人民军医出版社,1996,65~67.

  7 thornton ca,griggs rc,moxley iii rt.myotonic dystrophy with no trinucleotide repeat expansion.ann neurol,1994,35:269.

  8 reardon w,harley hg,brook jd,et al.minimal experession of myotonic dystrophy:a clinical and molecular analysis.j med genet,1992,29:770.

  9 o,hoy kl,tsilfidis c,mahadevan ms,et al.reduction in size of the myotonic dystrophy trinucleotide repeat mutation during transmission.science,1993,259:809.

  10 wong ljc,ashizawa t,monckton dg,et al.somatic heterogeneity of ctg repeat in myotonic dystrophy is age and size dependent.am j hum genet,1995,56:114.

  11 lavedan c,hofmann r h,rabes jp,et al.different sex dependent constraints in ctg length variation as explanation for congenital myotonic dystrophy.lancet,1993,341:237.

  12 jansen g,willams p,coerwinkel m,et al.gonosomal mosaicism in myotonic dystrophy patients:involvement of mitotic events in (ctg)n repeat variation and selection against extreme expansion in sperm.am j hum genet,1994,54:575.

  13 daumerie cg,lannoy n,squifflet jp.high ctg repeat number in nodular thyroid tissue from a myotonic dystrophy patient.j med genet,1994,31:891.

  14 lavedan c,hofmann rh,sheboune p,et al.myotonic dystrophy:size-and sex-dependent dynamics of ctg meiotic instability,and somatic mosaicism.am j genet,1993,52:875.

(1999-03-10收稿)

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