癌基因的活化使正常细胞生活周期的脱轨而导致细胞的转化或瘤化甚至癌化，生物学和不同医学领域的科学家们已达成共识，有关讨论，可从病毒src（鸡肉瘤基因）的活化作用开始。

    v-src 是由细胞的c-src而来。c-src从宿主细胞基因转导至鸡肉瘤病毒基因组成为v-src并在病毒活动子的调控下，当逆转病毒再感染时，其基因组整合于细胞基因组成为前病毒。前病毒又将其所带的v-src反回来转导至细胞基因组，这就是我们称之为v-src反复重叠的分子寄生现象，也就是病毒癌基因反复重叠寄生于病毒基因组和细胞基因组的作用。原癌基因可发生点突变（point mutation），例如c-Ha-ras 。在另一原癌基因c-myc的转录（产生mRNA）和翻译（产生蛋白）增强的情况下，可引起逆转病毒长末端重复序列（LTR）中的启动子或增强子发生插入突变，其结果是其产物的AA序列发生改变（如点突变），缺失或杂种形式（hybridnprotein）。原癌基因活化，常可与基因数的增加同时发生，这就是所谓基因的放大作用（amplification），如N-myc。染色体易位（chromosome translocation），常随有癌基因的易位和融合蛋白的形成（如bcr-abl）。此外，还可有两种癌基因的相互协同作用如 pp60c-src之于DNA肿瘤病毒的中T抗原转导、突变（点突变，插入突变，缺失），放大、染色体易位、癌基因的协同作用等，都是使细胞失去正常生长调节的重要机制。

下面将就逆转病毒的转化作用，作较为详细的介绍。

一、逆转病毒的转化基因

    很多编码核癌蛋白（nuclear oncoprotein）的基因，都是作为转化基因从鸟和小鼠逆转病毒的实验诱发或天然发生的肿瘤分离到的。转导的肿瘤基因常因插入于有复制功能的逆转病毒的结构基因之中，并取其部分而代之。也就是说，细胞的癌基因在其原来细胞组的部位表达，是显示正常调控功能的，而移到了病毒结构基因之中，处在病毒调节基因的控制之下进行表达，并且是在高水平时，就对细胞产生不利影响了。

    逆转病毒基因组由两条等同的RNA链组成，每股长5－10kb，能编码1－10个多肽。一般分为三个编码区：gag区编码大的结构蛋白，组成核衣壳，属组特异性抗原（group specific antigen,gag）；pol区编码逆转录酶和前病毒整合酶； env区编码襄膜糖蛋白，具病毒种特异性有一些逆转病毒只含上三种基因，另一些逆转病毒，尚含肿瘤基因（oncogene,v-onc）可引起宿主细胞的转化，但不参加病毒的复制，基因组的两端，都有一个长末端重复序列（promoter and enhancer），含调节基因启动子和加强子（promoter and enhancer），有调控病毒RNA合成作用。LTR无论在病毒基因组哪一端发生缺失（deletion），都使病毒基因不能进行整合，这表明LTR在病毒基因的整合作用，但同基因的表达无关。

    逆转病毒感染细胞时，通过病毒的特异性襄膜糖蛋白分子同宿主细胞表面的受体蛋白分子相结合，病毒基因组进入细胞后，以其本身带入的逆转录酶从病毒RNA逆转录成双股DNA以后即整合入宿主细胞基因组。此步骤依赖病毒整合酶的作用。整合的病毒基因组，即称为前病毒（provirus）。至此，逆转病毒完成了其生活周期的一半，以后的一半，即病毒基因转录、RNA合成、处理和翻译等，都需要借用宿主的酶系统进行。新合成的病毒RNA和蛋白分子，移聚于细胞表面成为颗粒，靠芽生机制从细胞膜释放，至此才完成逆转病毒的生活周期。

    逆转病毒科包含6个属（genus），参看表35－1。分别为A、B、C、D、E、F通常亦称为型。基中，B，C，D型有其特殊的电镜形态。B型与乳腺癌有关，核心（core）偏于病毒颗粒一边；C型与其他多种肿瘤有关，如癌（carcinoma）、肉瘤（sarcoma）、白血病（leukemia）、淋巴瘤（lymphoma）等。核心位于颗粒中央。B型病毒的核心则呈砖形。A型病毒只见于细胞内。

表35－1逆转病毒科

属
 亚属
 种
 
池病毒A
 　 　
小鼠，地鼠，豚鼠
 　 　
　 　 小鼠乳腺瘤病毒：MMTVS（Bittner’s病毒），
 
肿瘤病毒B
 　 MMTVP GR病毒，MMTV－L
 
肿瘤病毒C
 鸟类
 Rous肉瘤病毒（RSV）
 
　 　 Rous相关病毒（RAV）
 
　 　 其他鸡肉瘤病毒
 
　 　 白血病病毒（ALV）
 
　 　 鸟红母鸡肉瘤病毒（REV）
 
　 　 鸟髓母细胞病病毒（AMV）
 
　 　 鸟髓细胞瘤病毒
 
　 　 网质内皮细胞病病毒
 
　 　 野鸡病毒
 
　 哺乳类
 小鼠肉瘤病毒（MSV）
 
　 　 小鼠白血病病毒G（Gross或AKR）
 
　 　 小鼠白血病病毒
 
　 　 （MLV）－F，M，R（Friend,Monoley,Rouscher）病毒
 
　 　 小鼠放线白血病病毒
 
　 　 小鼠内源性病毒
 
　 　 大鼠白血病病毒
 
　 　 猫白血病病毒
 
　 　 猫肉瘤病毒
 
　 　 猫内源性病毒（RD114）
 
　 　 地鼠白血病病毒（HLV）
 
　 　 猪白血病病毒
 
　 　 牛白血病病毒
 
　 　 灵长类肉瘤病毒（绒毛猴，长臂猿）
 
　 　 灵长类肉相关病毒
 
　 　 灵长类内源性病毒
 
　 　 人T细胞淋巴嗜性病毒（HTLV-1,-2.-3）
 
肿瘤病毒D
 爬虫类
 Viper蛇病毒
 
　 灵长类
 Mason-pfizer 猴病毒（MPMV）
 
　 　 Langur病毒（长尾猴道逆转病毒）
 
　 　 松鼠猴病毒
 
慢病毒E
 　 羊Visna病毒
 
　 　 Maedi病毒
 
泡漠病毒F
 　 灵长类、人牛泡漠病毒
 

    含v-onc的病毒几乎都为缺陷病毒，由于病毒基因（gag,pol,env）有部分序列为v-onc所代替，以致不能进行正常的复制。此外，还由于v-onc可位于病毒基因组的调节序列的附近而不再受细胞调节，致使v-onc可进行高度的表达，这些都可能引起细胞转化。

    RNA肿瘤病毒和DNA肿瘤病毒，有其功能性的区别：①RNA肿瘤病毒的v-onc只有转化作用，而无复制作用；DNA肿瘤病毒的v-onc对复制和转化都有作用；②RNA肿瘤病毒的v-onc，都在宿主细胞基因组中，有其对应结构c-onc,已证明v-onc实来源于c-onc；而DNA肿瘤病毒的v-onc则属病毒的早期复制基因；③有不含v-onc的逆转病毒存在。但可引起慢性转化，此因病毒复制过程中的病毒刚好随机位于c-onc的上游所致。

（一）逆转病毒的转导

    逆转病毒的转导作为c-onc的活化机制之一，有助于进行转导的细胞获得生长优势。有些c-onc也易于转导，如c-myc插入于猫白血病毒基因组（FeLV），c-erbB插入于鸟白血病毒（ALV）基因组。但有的如 int-1 则不易转导，其机理不明。c-onc转导的第一步，是c-onc整合于其上游的能正常进行复制的前病毒中，前病毒和插入的c-onc都在同一转录方向，下一步就是5’LTR开始转录并在下游细胞序列的某一点附加多聚A，这可有两种方式完成此一步骤。一是染色体缺失可能同前病毒内区的细胞基因序列相融合，一是转录通过3’LTR，在拼接后，病毒内区和细胞序列相连接，最少有两个例子是这样转导的，即鸡的c-erbB和小鼠的c-myb。

(二)前病毒插入

    虽然有些被转导的c-onc是由逆转病毒携带的，如ras家族，但很多逆转病毒都不携带可转导的onc，大多数逆转病毒的转化潜能似乎在于其复制能力，这种复制能力调节细胞内的病毒颗粒数，数目愈大，整合的机会愈多，逆转病毒通过整合作用而表现其转化能力就愈强。

    有4种可能机制使病毒活化生长剌激基因：①前病毒插入时，其启动子对杂种m RNA的合成，起到充分的调节作用；②提供病毒转录增强子，以加强正常的或新的启动子对目的基因mRNA的表达作用；③插入作用可能使位于活化基因下游的mRNA多聚A化；④在前病毒插入过程中，编码序列常在N端被截断，前病毒插入时，还可发生继发性突变，此又对前病毒或细胞基因发生影响。

    前病毒的插入突变，是首先在鸟白血病病毒（ALV）发现的，此病毒引起鸡B细胞的淋巴瘤、红母细胞瘤、纤维肉瘤、肾母细胞瘤和血管肉瘤。整合的ALV前病毒的LTR启动子序列，位于 c-onc邻近，促进本来静止的 c-onc的转录，产生在5’端带有病毒转录物的 c-onc mRNA。此增强的 c-onc产物，导致细胞转化，这就是ALV引起的细胞转化的一种机制。

    相继的研究表明，ALV诱发的淋巴瘤细胞中，myc的表达比未转化的鸡细胞高50－100倍。其他 onc 的m RNA水平，包括src,fps,erb,myb等，则未升高。这似乎表明，ALY诱发淋巴瘤，与前病毒插入引起的c-onc表达增强有关，另外的证据是，在同一条RNA转录物上，同时见有myc特异序列和病毒特异序列。且限制性内切酶图谱表明前病毒和c-myc序列，位于同一DNA片段上。由此可知，ALV诱导的恶性转化，是病毒启动子插入于 c-myc癌基因的上游，以致使 c-myc活化表达的结果，所以，逆转病毒的转导和前病毒的插入，是相似的但可区别的 c-onc活化机制。在病毒转导中，病毒摄取整个或部分c-onc并置于本身启动子的作用之下，在插入宿主细胞基因组后，作为v-onc基因进行表达。在前病毒插入中，病毒本身并未带有onc，而是插入病毒启动子，指导细胞基因组中c-onc的表达。由此可见分子生态条件的微妙之处。

（三）点突变

    70年代的实验研究表明，从肿瘤细胞提取的DNA转移至正常细胞，可引起后者转化为带有恶性表型的细胞，如失去贴壁性，形成细胞灶、注射动物成瘤等，化学诱导的啮齿动物细胞转化后的细胞DNA转移至NIH3T3小鼠成纤维细胞系，也可引起转化。以后应用于人肿瘤细胞的研究，也都证明多种类型的肿瘤细胞，都有多种onc的存在，最常遇到的onc是ras家族，N-ras见于神经母细胞瘤（neuroblastoma,为N－ras）、色素瘤（melanoma），纤维肉瘤（fibrosarcoma）、髓白血病（myeloid leukemia）等。c-ki-ras见于胰腺癌和肠癌，trk 见于胰腺癌。序列研究表明，这些onc同其对应的c-onc比较时，发现有点突变。例如v-Ha-ras的长约6000 bp，只有4个 bp残基的点易于突变，而赋予onc以转化活性，突变点并不是随意的，常发点是序列部位12，13，59和61；除了P53是一种例外之外，所有发生点突变的onc都有剌激生长的性质。

（四）基因重排

    在多人肿瘤中，染 色体不正常。在某些肿瘤有明显的染色体易位，常见的有t（10：18），如在多种肿瘤，可见t（8：14）。Pli染色体的易位时常伴有onc的活化，白染色体是一个典型代表。C-abl是编码核蛋白酪氨酸激酶的onc，正常时位于染色体9q34，在CML则易位至22 qll的称为breakpoint cluster region(bcr)的部位，结果组成一个融合基因bcr-abl并编码基因混合蛋白bcr-abl。 Bcr区约为 5.5kb。以后还将就此进行讨论。

    另一常见易位的onc是 myc，这正常位于8q24，常易位于22qll的bcr区或其他三个 Ig位点，即14q34、2p13或22qll，常见于淋巴样瘤，特别是Burkitt淋巴瘤，所有这些易位都使 myc置于Ig启动子的控制之下。

    再常见的易位融合基因是18q21的bcl－2基因易位于14q32处的IgH链基因，这一重排常见于滤泡性淋巴瘤。

（五）基因放大（gene amplification）

    肿瘤细胞染色体的改变，有的是由于基因的放大。有两个不正常的特点，是由于基因的放大，那就是：①染色体内的习质性着色区（homogenenusly staining region HSR）；②称为双微粒（double minute,DM）的DM是相对稳定的放大了的DNA聚集体。放大体的大小可从100kb到1000kb以上，界限也不规律，DM是放大DNA序列的集合体，DM的聚合和插入可能是HSR 发生的原因。第一个被发现的onc放大是细胞系HL－60中的c-myc，以后在多种人癌细胞系如大肠癌、小细胞肺癌、神经母细胞瘤等，都见有c－myc的放大，在SCLC等还鉴定出N- myc和L -myc的放大，人肿瘤所见的基因如表35－2。

表35－2 人肿瘤中原癌基因的放大

基因
 瘤型
 
c-myc
 小细胞肺癌
 
　 胃腺癌
 
　 乳腺癌
 
N-myc
 神经母细胞瘤
 
　 小细胞肺癌
 
l-myc
 小细胞肺癌
 
c-myb
 肠癌
 
　 急性髓白血病
 
c-erbB
 上皮癌
 
　 胶母细胞瘤
 
Neu/erB2
 男癌
 
　 乳腺癌
 
c-abl
 慢性髓细胞白血病
 

二、癌基因在肿瘤发生中的作用

    当初的研究认为癌蛋白一定是在核内发生作用，因为那里是DNA复制和RNA 合成的地方。以后的研究表明，癌基因蛋白不仅在核中存在，还在胞膜甚至外空间存在；有三种实验途径，以鉴定癌基因蛋白特点：克隆基因核苷酸序列分析能推道出癌蛋白的原发结构，抗体与蛋白生化的连合应用和细胞分片（rfactionsation）技术，可用于测定癌蛋白的原发结构，抗体与蛋白生化的连合应用和细胞分片，可用于测定生化性，及解释癌基因表达的生物学生结果，根据这些标准，可将癌基因及其产物分为4类：①分泌的胞外多肽如生长因子；②膜蛋白激酶，如src、abl等，此家族还包括跨膜生长因子；③膜信号转导蛋白，ras家族为典型成员；④核癌蛋白，属转录调控因子，下面将分别介绍。

（一）生长因子

    到现在为止，已证明有多种癌蛋白（oncoprotein）与生长因子有同源性，并有相似的剌激细胞生长的功能，已知例子，列于表35－3。

    1．v-sis和PDGF 人血小板来源生长因子（PDGF）是由A、B两肽以二硫键组成的双体，AA、AB、BB双体形式的特异生物学功能尚在研究之中，但AA、BB已知存在于些细胞系。表现一定的生物学功能。

    SSV（猴肉瘤病毒）的v-sis，是第一个发现的癌基因生长因子，称P28 v-sis，即指c-sis 基因编码的蛋白为28kDa，与人PDGF-B链相同，v-sis蛋白同PDGF有类似作用。通过同PDGF受体相结合，而剌激信号传导旁路，引起细胞转化，v-sis的转化能力同其诱导高水平PDGF的产生有密切关系。v-sis只能引起具有PDGF受体的细胞发生变化。

表35－3 生长因子和受体

癌基因
 细胞同源物
 动物／肿瘤
 人肿瘤
 
Sis
 PDGF
 猴／肉瘤
 乳腺癌
 
Int-2
 FGF类
 小鼠神经母细胞瘤
 乳腺、卵巢、前列腺癌
 
　 　 　 胶母细胞瘤
 
ErbB
 EGF－R
 鸡／肉瘤
 
Kit
 　 红血细胞白血病
 　
Fms
 M－CSF
 猫／肉瘤
 　
Erb-A
 甲腺受体
 子宫内瘤
 　
　 IL-2
 红细胞白血病
 　
　 IL-3
 长臂猿T细胞淋巴瘤
 　
　 　 小鼠／T细胞淋巴，星细胞瘤
 　
Ros
 　 鸡／肉瘤
 　

    v-sis转化作用的机制，仍是研究重点，可能由于存于细胞外的PDGF同细胞表面相应的特异受体相结合。实验证明高浓度的抗PDGF抗体能抑制细胞生长，并能使v-sis转化了的细胞逆转，这可能由于抗体中和了胞外可溶性的PDGF，使之不能到达受体与之结合，这在其他生长因子，如白细胞介素GM－CSF，CSF－1以及转化生长因子-α（TGFα）都可观察到。并且还表明生长因子的自泌生长环，即分泌的生长因子又转回来同自身生长因子受体相结合而诱导细胞生长。

    v-sis的另一作用特点是，其自泌环可在细胞内完成。最近的研究表明，PDGF和其受体的结合，早已发生于这两种分子到达细胞表面之前，实验证明，PDGF受体未达到细胞表面，仍停留在ER及Golgi器的v-sis蛋白能与之结合，结果使细胞发生转化。

    还有证据表明，PDGFR的另一底物是PLC（phospholipase C），说明PDGF的作用还涉及磷酸肌醇的代谢。PDGFR的激酶区，可能介导受体同c-raf-1癌基因编码的丝氨酸／苏氨酸激酶的结合。

    2．EGFR和neu 人上皮生长因子受体（EGFR）同鸡的erbB癌基因转化蛋白，有显著的同源性，在600bp序列中，显示90％以上的同源性。这表明，erbB蛋白是EGFR的截断部，只缺少胞外结合区，还保留膜结合区，现认为EGF和erbB都能结合EGFR而引起细胞转化。

    同EGFR相关的分子有几种，neu癌基因编码的P185 neu即是其中之一，neu蛋白是啮齿动物产物，同EGF的结构相似，属酪氨酸激酶，如在跨膜区发生点突变（valine→glutamic acid）而活化，正常细胞的neu蛋白，称为P185c-neu，激酶活性较弱。同EGFR也有明显同源性，说明P185c-neu也可能是一种生长因子的受体。

    Neu癌基因是首次在大鼠神经母细胞瘤中发现的，与neu有同源性的人erbB-2癌基因，在很多人腺癌的发生频率很高，特别同乳腺癌和前列腺癌的预后有关，此onc位于人17q21。

    EGF和erbB-2在试管内的转化作用研究较多，EGF依赖于EGFR以剌激正常细胞和转化细胞生长，结果是P185c-neu 的酪氨酸磷酸化增加，同时伴有相应的酪氨酸激酶活性增加。以erbB-2转染NIH3T3细胞，结果有P185c-neu 过度表示，并发生细胞转化，但同样的实验，以c-neu转染NIH3T3，也有P185c-neu 高度表示，而未见细胞转化，以抗neu的作用于neu转化的NIH3T3细胞时，可使表面nen的表达水平下降。

    EGFR过度表达可出现EGF依赖性转化，但转化细胞接种裸鼠不能成瘤。最近发现有的细胞系同时出现P185c-neu 和EGFR的过度表达，转化标志是：形态改变，转化灶形成，软琼脂集落生长，裸鼠成瘤。似乎表明EGFR和P185c-neu 协同作用引起成纤维细胞系的转化，协同机制尚等阐明。

    EGF诱导的PLC－Ⅱ的酪氨酸磷酸化，可能是使EGFR的酪氨酸激活性同磷酸肌醇水解信号旁路相连接。这样的信号连接已见于PDGF的活化机制，所有这些信号旁路的协同作用，肯定对某一细胞的转化能力发生影响。

（二）蛋白激酶

1．酪氨酸激酶

    （1）Philadelphia染色体（Ph’）和abl CML是一种骨髓克隆病，以粒细胞瘤性过度增生为特征，发源于多能干细胞，导致所有血细胞都有涉及，90％的CML患者都有Ph’可查，是t(9：22)（q34：qll）的易位导致。虽然也可发现9号染色体以外的染色体易位，但所有CML患者，都有9染色体的易位，除9和22染色体以外的复杂易位也有报道。这种染色体重排可能掩盖Ph’而错误地判断为Ph－。另外的核型变化，可能是病情由慢性转变为急性的结果。最常见的第二Ph’，isochromosome17，＋19，和Trisormy8。必须指出，即使在典型的CML，也有20％25％的细胞缺乏Ph’，这可能是由于正常细胞残余的存在。

     T（9：22）（q34:q11）重排的结果，有两个特异基因移至邻位（juxtaposed）形成杂种基因（chimeric gene），其蛋白产物则颇具特性。C-abl 原癌基因从染色体9移至染色体22的限制性断裂区（breakpoint cluster region bcr），所以ber-abl就成为染色体22上的杂种基因，也即融合基因（hybrid gene）。C-abl是正常细胞的基因，同Abelson小鼠白血病毒所带的转化性v-abl癌基因相对应。此基因只有5.8kb长，bcr区已被克隆，含bcr-abl的mRNA已证明其存在，其翻译产物为210kDa蛋白。而c-abl 蛋白只为145 kDa，所以bcr的融合可视作c-abl活化而成为带有v-abl转化性癌基因的结果。

    （2）c-abl c-abl位于染色体9q34,近着丝点（centromere）5’端，编码区只占100kb基因长度，编码7 kDa，c-abl蛋白的一部分同其他酪氨酸激酶家族的蛋白有同源性，有4种形式的mRNA存在，只在N端有别，C端共用，每一mRNA有其本身的启动子。

     人c-abl 150 kDa 磷蛋白，有两种形式存在，即膜结合或胞浆溶解。N端结合于14烷（myristilate）脂肪酸时，有助其同膜结合，虽同其他酸氨酸激酶有同源性，但未证明c-abl蛋白有激酶活性， c-abl蛋白常有丝氨酸残基磷酸化，表明有可能 c-abl选择性的使一定数目的蛋白磷酸化而有传导信号的作用。

    （3）v-abl v-abl是Abelson小鼠白血病毒（Ab-MLV）的癌基因蛋白，此为复制缺陷病毒引起小鼠淋巴瘤同其他病毒的肿瘤基因一样，v-abl 是由病毒的gag基因同3’小鼠 c-abl基因融合而成（gag-abl）。gga序列加到 c-abl 的5’端，可以解释为什么转化性蛋白可以自身磷酸化酪氨酸,同时也可磷酸化其他蛋白的酪氨酸残基。v-abl 除引起淋巴瘤外，还能转化成纤维细胞、淋巴细胞和他种培养的细胞。

    使v-abl失去酪氨酸激酶活性的突变，也失去了转化活性。例如，gag基因的缺失，虽不影响对成纤维细胞的转化力，但失去了对淋巴细胞的转化力。c-abl N端的139残对于诱导转化活性是必需的。在src蛋白和其他激酶，也有与此类似的同源序列存在。说明这一节段确实为调节区，能调节激酶区的激酶活性，c-abl的活化最少部分是由于这一调节区的存在，其他onc蛋白具有激酶活性者，参看表35－4。

表35－4一些表现激酶活性的癌基因

癌基因
 动物／肿瘤
 人细胞瘤
 
Src family
 　 　
　 鸡／肉瘤
 　
Src
 猪／肉瘤
 　
Yes
 　 　
Fgr
 　 ？T细胞淋巴瘤
 
Lck
 　 ？T细胞淋巴瘤
 
Fyn
 　 　
Hck
 　 　
Abl
 小鼠猫／肉瘤
 CML／AML／ALL
 
　 前B细胞淋巴瘤
 　
Raf
 小鼠／肉瘤
 　

     (4)bcr bcr基因位于22qll，同c-abl融合为bcr-abl,这是Ph染色体的特点，是t（9：22）（q34：qll）的易位所致，在所有成血系及骨髓，都有两种mRNA，分别为4500和4700bpta ,bcr蛋白为190kDa磷蛋白，其丝氨酸残基能自身磷酸或被其他丝氨酸激酶磷酸化。Bcr基因只有5.8kb和, bcr-abl融合基因编码P210，P210能磷酸化本身的酷氨酸残基，也能作为激酶使其他蛋白酶氨酸残基磷酸化。

    （5）P210 似乎在CML中起重要的发病作用。急性淋巴细胞白血病（ALL）也涉及bcr基因但其融合基因编码的蛋白为P190，但基磷酸化激酸活性则无二致。在ALL患者，Ph＋的预后比Ph者为差。

    （6）src家族 这一基因家族编码的蛋白，相当复杂，有癌蛋白、蛋白激酶、生长因子受体等，此家族的原始成员v-src编码60 kDa磷蛋白P60 v-src，位于胞膜浆面，有酷氨酸激酶活性。v-src是首先发现的癌基因，与鸡肉瘤有关，是Rous肉瘤病毒的病毒肿瘤基因。

     v-src家族尚有v-yes,v-fgr,v-fps,v-ros,v-abl等，v-erbB 和v-fms亦属之。

     v-src蛋白一经合成，很快结合于50 kDa和90 kDa的两种细胞蛋白，组成多聚体，多种刺激包括热休克都能促成此复合物的形成，在合成中或合成以后，v-src蛋白氨基端的甲硫氨酸（methionine）被去掉，一个14碳脂肪酸（myristic acid）则附着于邻近暴露的赖氨酸（ylycine），这一14烷化后合成过程，对于v-src蛋白定位于胞膜和表现转化力，都是必需的条件，但还是不够的，v-src家族其成员的蛋白产物为abl,fes,也需要脂肪酸化（myristolatel），但脂肪酸的附着点是MLVgag-ocn融合蛋白中的gag序列。在合成后10分钏内PP60 v-src即细胞骨架附着于胞膜的所在。这也可能是PP60 v-src激酶活性作用的靶点。

    （7）v-src的活化v-src的酷氨酸激活性被认为是转化作用所必需的，在酷氨酸磷酸化点或包含此点416位的区域发生突变时，此突变蛋白仍保留共激酶活性和转化能力，但致癌活性则有所改变。激酶活性受其他方式的调控，在PP60 v-src中，有未经确定的N端磷酸化点，足以增强激活性，但在C端527位的酷氨酸残基磷酸化时，则对磷酶活性有负影响。在氨基酸527位突变时为非酸化的苯丙氨酸（phenylalanine）时则PP60 v-src又回复为转化为蛋白。这些观察表明，酷氨酸416的磷酸化，只是v-src蛋白内在激酶活性的一个指征（indicator）而不是一个决定者（deteminant）。转化c-src为转化基因的原始事件，是通过c-srcC端调节残基的缺失或突变其活笥的。

    蛋白激酶活化点可能位于具有最大保守性的区内，因为人为地使比区发生突变，对于激酶活性和转化性都有损伤。但其他区域如C端的突变，也能损害生物学和生化学功能。

    c-src也能在酪氨酸以外的残基发生磷酸化。特别是丝氨酸和苏氨酸的磷酸化能损害src激酶活性的调节作用。P60 c-src在丝12和丝17位被PKC和cAMP依赖性蛋白激酶磷酸化。在P60 c-src苏34苏46和丝72位在P34cdc2诱导的成纤维细胞分裂期也被磷酸化，P60 c-src可能在细胞分裂时作为效应激酶，以扩大P34cdc2诱导的多种细胞骨架和形成学改变的信号。

    P60 c-src蛋白激酶作用底物，可能有多种：PP36，一种浆溶性蛋白，一种42kDa蛋白的同型体，被肿瘤启动分子和生长因子剌激PKC后磷酸化；受三种酶（enolase ,phosphoglycerol mer stase,lactic dehydrogenase）酶解后的底物蛋白成分；PP50cell，含有PP60v-src的胞复合体等均属之。

    PP60v-src还能使非常特殊的底物磷化酸化，包括甘油、核甘酸、磷酸肌醇、甘油二酯（DAG）等。Src蛋白还可能有磷脂激酶（phospholipid dinase）作用。由此可知src基因的分子内外的分了生态关系是极其复杂的。

    2．丝／苏氨酸激酶 c-raf为胞浆蛋白，有内丝／苏氨酸酶活性，其相应的v-raf则有转化活性。c-raf与v-raf的区别在于，v-raf的N缩短，缺少了调节区。这一改变使激酶活性变为固有化（constitutive），c-raf 活化可发生于受PDGF剌激的静止细胞和有v-raf表达的细胞。说明v-raf和c-raf两种onc可同时在一种细胞活性表达。c-raf活化的结果是自身丝／苏氨酸的自身磷酸化，c-raf活化则也见于EGF，FGF（fibroblast）等生因子剌激的细胞，以及有膜肿瘤基因（v-fms,v-Ha-ras）表达的细胞，但不见有v-fos，c-myc等核肿瘤基因表达的细胞，以佛波酯剌激细胞，通过PKC的作用，而使c-raf酶活化，但无c-raf的磷酸化，由此，有两种不同机制使c-raf激活，一是应答PDGF的剌激导致酷氨酸的磷酸化，二是应答于佛波酯的刺激并不伴有酷氨磷酸化的c-raf的活化。c-raf多途径活化的机制表明v-raf 蛋白是细胞多种增殖信号的共同介体。

    在多种生长因子的剌激信号传导，中，活化的c-raf 蛋白作用的底物，可能在核内，c-raf 蛋白活化后向核移动，可能增强某些核onc 的表达，如c-raf 等，以致成为一个将膜外信号传导至核内以加强核基因转录的有效传导系统。

（三）信号传导

    1．Ras基因家族 ras onc原始发现于RSV的 Harvey和Kirsten毒株，以后明很多人肿瘤都有ras基因的活化。Ras基因有三种，即H-ras，K-ras和N-ras 前二者名称来源于肿瘤病毒，如上所述，后一名称来源于肿瘤细胞因首先在人neuroblastoma中发现。所有三种基ras因都编码相似蛋白，都为189AA长，都是21 kDa分子量。

    对ras基因的突变研究，原来是以对NIH3T3细胞转化作用为根据。目前应用的方法有三种，即：①选择性分子杂交，用人工合成的寡核苷酸探针，对已知突变是行特异的；②Rnasemismatch cleavage,即RNA探针同突变的DNA形成不相配对的杂交分子，然后以RnaseH除去杂交分子中的RNA，生成的两个片段，琼胶电泳分离；③多聚酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增后直接分析ras的突变。

    Ras的好发突变点有4处，即AA残基的12，13，59和位61痊，结果是，高度保守性的N端的三维结构发生改变，人肿瘤中所有发现的ras基因的变化，都有这样单一的活化性突变。

    Ras蛋白和G蛋白腺苷分化因子诱导的信号传递中起作用。基模式是，ras蛋白因剌激而活化将信号至胞内效应分子，最后变为失活；突变的ras蛋白，则不能回至失活状态而自由地剌激细胞生长。

    （1）ras的功能性 rasP21鸟类核苷酸紧密结合于浆膜的浆面。定位于浆面是由于C端发生后翻译改变的结果，它获得了CAAX序列。以后CAAX被解除，在C端cysteine和分支逻的多不包饱和炭轻醇（farnesol法呢醇）之间以硫醚链（thiether）连接（lindage）。这一反应称为法呢醇化（farnesylation）法呢醇是合成胆固醇的中间代谢产生，接近于端的CAAX序列第二cysteine残基反过来（reversible）附着棕榈酸（palmific acid）这一反应称为棕榈酸化（十六烷酸化）。这样就显示出ras蛋白出在细胞内的调节,共价结合的法呢醇和棕榈酸被人为有介导ras蛋白结合细胞膜并影响其癌性活性的作用。

    （2）ras蛋白的活化机制 ras蛋白同G蛋白有类似的功能。其根据是，两者都同GDP和GTP结合，两者都定位于浆膜的浆面。虽然G蛋白具有内GTPase活性，使GTP变为GDP，而从病毒变化细胞分离的P21似乎无此作用，但重组入Ha-ras－1P21及其癌基因同源体从EJ／T24膀胱癌分离的缬－12突变种，表达于E.coli时，Ha-ras－1确可显示内GTPase活性，只是同典型G蛋白相比作用较慢而已。

    RasP21在信号传递中起作用，以同GTP或GDP结合为转移。P21·GDP为无活性形式。外来信号使P21离开GDP转而同GTP转而同GTP结合，成为活性形式的P21·GDP，这同G蛋白联系的受体配体作用后发生的GDP与GTP对G对蛋白结合之间的转换是相似的。P21·GDP在活化一种效应分子后，GTP，水解为GDP使P21GDP从活性形式转换是相似的P21·GDP的无活性形式，P21发生缬一12突变时，则失了GTPase激酶活性，但保持其信号效应的功能。这种已失调节活笥的效应分子的长期剌激，就导致细胞的无限增殖而显示癌化现象。多种系统中的P21突变，都提示癌基因突变，引起发生变化，这就化或者减低GTPase 活性使P21与GDP结合而处于活化状态，或者使无活性形式的P21GDP失去基称定性。最近有资料表明，P21突变仍保持原有的GTPase 活性。还有GTPase 活性减少的突变，不一定与生物学性关联。天冬氨酸12（Aspartate-12）突变居NrasP21，其GTPase活性，与正常P21的GTPase相比,只减低属具有高度生物学活性转化蛋白。这表明正常蛋白和癌蛋白活性之间的生化差异，不能只GTPase的活性降低为标准。

    近来来发现了一种新的蛋白GAP，即GTPase活化蛋白（GTPase activating protein），它能使正常P21R GTPase活性比aspartate-12或valine-12突变P21的活性增加500倍。在GAP存在的条件下，rasP21的癌基因活性，紧密的同时GTPase活性的降低相关联。GAP还可能维持正常P21于同GDP结合非常性状态，而ras P21的癌性突变，则可能逃脱此一机制的调节而处于同GTP结合性状态。

    最近在Nature、Scice、Cll等刊物上，发表了多篇论文讨论ras在信号传递中的作用。这些作用都述了Grb2同ras是活化因子（ras activator）结合，然后同受体酪氨酸激酶相结合成为称定的复合物。Ras活化因子称为SOS。图35-1可说明受体活体与ras活化分子生态关系。

    Grb2通过SH2同活化的受体结合，通过SH3同SOS结合。SOS为 ras 活化因子，受体关联的SOS促进GDP－GTP同ras结合的交换而使ras－GTP活化形成中的丝／苏氨酸激酶活化，使信号从细胞表面到达核内。SH2。SH3为src同源区，SH2为特异酷氨酸磷蛋白的结合点，SH3为特异甫氨酸丰富区。它们存在于多种信号传递蛋白。Grb2是已知的最典型的衔接蛋白（adaptor protein）。其他尚有shc,crk,Nck等。这些衔接蛋白通过SH2、SH3一同与别的信号蛋白结合，SH2和酷氨酸磷蛋白之间及SH3和其靶点之间的相互作用，可以组成无数的蛋白与蛋白的结合。由图可知，受体活化的结果是自身磷酸化，为Grb2提供一个结合点。Grb2与SOSI结合引起ras活化系统的高亲和性结合所必需的。上面提到的GAP，虽未在图中标出，但不说明GAP在ras活化系统的信号传递中不起作用，可能Grb2介导的rasGTP信号系统的有效传递，是在GAP受到抑制的条件下进行的。这里不防引用GAP对rasP21介导的活化形式的抑制作用（促P21GTP水解）示意图，以资参考。

    35－2GAP是ras的效应分子和调节者。在正常情况下，P21GAP在膜上转换为21GTP（机制不明），并同GAP结合。由于GAP是胞溶性蛋白，能短暂地结合于膜上的21GTP此时P21GTPGAP向细胞送去分裂信号。当GTP水解时，P21GTPGAP复合体离解，GP回至胞溶状态，信号传递停止，在转化细胞中突变的P21不能被GAP诱导而水解GTP以致P21·GAP长期结合，信号传递永远不停止。

    （3）ras与癌 在多种人癌中，都有ras基因的突变活化，这里只列表35－5以资参考。

表35－5 肿瘤类型、百分率与癌基因活化

瘤的类型
 发生率（％） 明显 ras表达
 
肺腺癌
 30
 Ki-ras
 
肠腺癌
 50
 Ki-ras
 
胰癌
 90
 Ki-ras
 
精细胞
 40
 Ki-ras,
 
色素瘤
 20
 N-ras
 
膀胱癌
 6
 Ha-ras
 
甲腺癌
 50
 Ha-ras,Ki-ras,N-ras
 
髓发育异常
 30
 N-ras
 
急性髓细胞白血病（AML）
 30
 N-ras
 
慢性髓细胞白血病（CML）
 10
 N-ras
 
急性淋巴细胞白血病（ALL）
 10
 N-ras
 
宫颈癌

    2．核癌蛋白 癌蛋白定位和作用部位，也是多样性的，胞内外、核内外和膜上都有，图35－3表示癌蛋白的定位分布，也可视作癌蛋白的对细胞生态点分布。有关核蛋白的作用将在下一章进行较详细的讨论。

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